Analisis Vaksin Rabies

Vaksin apapun ketika akan dipasarkan haruslah memenuhi syarat uji. Pada kali ini akan dibahas mengenai beberapa cara analisis vaksin rabies. Berikut penjabarannya:

Baku Pembanding
Baku pembanding yang dipakai adalah BPFI (Baku Pembanding Farmakope Indonesia)

Identifikasi
Jika disuntikkan kepada hewan yang peka akan menimbulkan pembentukan antibodi rabies

Penetapan Potensi
1. Potensi vaksin rabies tidak kurang dari 2,5 unit per dosis dan batas kesalahan fidusial tidak kurang dari 25% dan tidak lebih dari 400%
2. Lakukan penetapan potensi dengan membandingkan dosis sediaan uji dan sediaan baku yang memberikan perlindungan sama bagi mencit terhadap efek virus rabies dosis tertentu yang diberikan secara intraserebral.

Hewan uji:
1. Sebagai hewan uji gunakan mencit sehat dari asal yang sama, umur kurang lebih 4 minggu dan bobot tubuh antara 11-15 gram.
2. Kelompokkan menjadi 6 kelompok masing-masing 16 ekor (untuk penetapan potensi) dan 4 kelompok masing-masing terdiri dari 10 ekor (untuk penetapan virus tatang), dari jenis kelamin yang sama atau jenis kelamin berbeda yang dibagi merata di antara kelompok.
3. Selama pengujian, hitung mencit yang mati atau menunjukkan gejala rabies (paralisis atau konvulsi), antara hari ke-5 hingga ke-14 stelah penyuntikkan virus. Mencit yang mati sebelum hari ke-5 tidak dihitung.

Suspensi virus tatang:
1. Biakkan galur Canine Street Virus (CSV) dari virus rabies dalam otak mencit
2. Panen virus dan buat sedemikian rupa sehingga diperoleh virus jernih dan disimpan dalam jumlah sedikit pada suhu di bawah -60°C
3. Encerkan suspensi segera sebelum digunakan dengan cairan yang sesuai hingga diperoleh suspensi virus tatang yang diperkirakan mengandung antara 5-50 dosis infektif 50% per 0,03 ml berdasarkan hasil titrasi pendahuluan. Tetapkan titer suspensi virus tatang bersamaan dengan penetapan potensi vaksin

Penetapan titer suspensi virus tatang
1. Buat 3 seri pengenceran suspensi virus tatang. Alokasikan suspensi virus tatang dan tiga pengencerannya pada masing-masing kelompok mencit yang terdiri dari 10 ekor.
2. Suntikkan secara intraserebral 0.03 ml suspensi virus tatang dan encerannya pada setiap mencit dalam masing-masing kelompok yang dialokasikan
3. Amati mencit selama 14 hari
4. Hitung titer suspensi virus tatang dalam dosis infektif 50% (ID50) per 0,03 ml dengan metode statistik baku dari jumlah mencit yang mati atau menunjukkan gejala rabies (paralisis atau konvulsi)

Prosedur
•Rekonstruksi sediaan baku dan sediaan uji vaksin yang akan ditetapkan potensinya
•Buat 3 seri pengenceran berkelipatan lima sediaan baku dan 3 seri pengenceran berkelipatan lima sediaan uji. Seri pengenceran sediaan baku dan sediaan uji dibuat sedemikian rupa sehingga pengenceran terendah melindungi lebih dari 50% yang telah ditatang dan pengenceran tertinggi melindungi kurang dari 50% mencit yang telah disuntik dengan cairan tatang
•Alokasikan tipe enceran sediaan baku dan sediaan uji pada masing-masing kelompok mencit yang terdiri dari 16 ekor. Suntikkan secara intraperitonial 0,5 ml tiap enceran pada tiap mencit dalam masing-masing kelompok yang telah diasosiasikan
•Setelah 7 hari, buat 3 pengenceran yang sama masing-masing sediaan baku dan sediaan uji, ulangi penyuntikkan.
•Amati mencit selama 14 hari
•Hitung potensi sediaan uji dengan menggunakkan cara statistik baku dari jumlah mencit yang dapat bertahan terhadap virus tatang
•Uji tidak absah, kecuali jika sediaan uji maupun sediaan baku yang dapat melindungi 50% hewan uji terletak antara dosis terendah dan dosis tertinggi yang diberikan pada mencit, kurva dosis respon yang menunjukkan kemiringan yang bermakna dengan deviasi yang tidak bermakna terhadap kesejajaran atau linearitas dan titer suspensi viru tatang antara 5 dan 50 ID50.

Uji Viabilitas
Uji viabilitas dilakukan untuk mengetahui titer dari suspensi CVS IP11 yang digunakan sebagai seed virus dalam produksi vaksin rabies.
Suspensi CVS IP11 disuntikkan pada 10 ekor mencit berat 11-13 gram secara intraserebral masing-masing 0,03 ml. Observasi selama 7-14 hari dan dilihat kematiannya dengan gejala rabies.

Uji Kontaminasi Bakteri
Sebelum hasil panen otak bayi mencit diinaktivasi (suspensi 10%), dilakukan titrasi untuk mengetahui kontaminasi bakteri.
Adapun caranya; disediakan 5 tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml thyoglycolate broth. Ke dalam tabung pertama dimasukkan 1 ml suspensi otak bayi mencit 10% sehingga didapat pengenceran 10-2. Cara yang sama diulang sampai ke tabung ke-5 sehingga didapat pengenceran 10-3,10-4,10-5,10-6. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 14 hari.

Uji Kontaminasi Virus Lain
Bersamaan dengan pelaksanaan uji kontaminasi bakteri dilakukan juga uji kontaminasi virus lain. Caranya: 0,5 ml supernatant dari suspensi 10% dicampur dengan 0,5 ml serum antirabies hiperimun undiluted. Kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu 37°C selama 80 menit dan disuntikkan pada 10 ekor mencit dengan berat 11-13 gram masing-masing 0,03 ml secara intraserebral dan 10 ekor bayi mencit yang berumur 0-4 hari masing-masing disuntik 0,01 ml secara intraserebral. Setelah observasi selama 30 hari, mencit dewasa dan bayi mencit harus tetap sehat. Bila ada mencit yang mati, dibuktikan kematiannya itu disebabkan oleh virus rabies atau virus neurotropik lainnya dengan cara melakukan uji netralisasi indeks.

Uji Keamanan (Safety Test)
Sampel uji berisi SMB (Suckling Mouse Brain) kering (produk akhir), kemudian diencerkan dengan aquabides hingga diperoleh suspensi 2%. Pengujian dilakukan terhadap 4 ekor cavia dengan berat kurang lebih 20 gram disuntikkan 0,5 ml secara subkutan.
Observasi selama 14 hari. Penimbangan sebelum dan sesudah percobaan harus menunjukkan kenaikan berat badan atau minimal konstan.

Penentuan N Total
Penentuan N total dilakukan secara Kjehdahl. Senyawa yang mengandung nitrogen didestruksi menjadi NH3 kemudian dititrasi secara asam basa.
Sebanyak 1 ml vaksin rabies dimasukkan ke dalam labu Kjehdahl dengan pertolongan air suling dan NaOH encer kemudian ditambahkan 1,30 ± 0,03 gram K2SO4, 40 ± 5 mg HgO dan 2 ml H2SO4. Ke dalam labu tersebut ditambahkan juga 1-2 butir batu didih dan destruksi di ruang asam kurang lebih 4 jam. Setelah dingin ditambahkan sedikit mungkin kurang lebih 5 ml aquades kemudian cairan dimasukkan ke dalam alat destilasi nitrogen secara kuantitatif. Tahap berikurnya tempatkan labu Erlenmeyer 125 ml sebagai penampung destilat yang berisi sampel uji ditambahkan 8 ml campuran NaOH dan Natrium tiosulfat serta uji ada tidaknya kelebihan asam dengan metal jingga. Selanjutnya dilakukan destilasi sampai lebih kurang 50 ml destilat tertampung. Destilat dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna.
Perhitungan:
P x NHCl x 14 = ……… mg N/ml
P = jumlah (ml) larutan HCl yang diperlukan dalam titrasi.

Pustaka:
Harmita. 2007. Analisis Hayati 2. Depok: Departemen Farmasi UI. Halaman 75-79.